Real time PCR법은 PCR 증폭량을 실시간으로 확인하면서 해석하는 방법으로 전기영동이 필요없이 신속하게 정량할 수 있다. Real time PCR을 위해서는 thermal cycler와 분광형광광도계를 일체화한 장치가 필요하다.

(1) Interchelating법
Double strand DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(inter-chelator: SYBR® Green I, EtBr 등)을 PCR 반응에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법이다.
Interchelator는 PCR반응으로 합성된 double strand DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다. 또한 증폭 DNA의 융해온도를 측정할 수 있다

(2) TaqManTM probe법
5’말단을 형광물질(FAM 등)로 3’말단을 quencher 물질(TAMRA 등)로 수식한 oligonucleotide
(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법이다.
TaqManTM probe는 annealing step에서 주형 DNA에 특이적으로 hybridize하지만, probe상에 quencher에 의해 형광 발생이 억제된다. Extension 반응시에 Taq DNA polymerase가 갖는 5’→ 3’exonuclease 활성으로 주형에 hybridize한 TaqManTM probe가 분해되어 형광색소가 probe에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발한다.

(3) Molecular Beacon법
양 말단을 형광물질(FAM, TAMRA 등)과 quencher 물질(DABCYL 등)로 수식한 헤어핀형 이차구조를 만드는 oligo-nucleotide probe Molecular Beacon probe를 PCR 반응계에 첨가하는 방법이다.
Molecular Beacon probe는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하고 형광물질과 quencher 물질이 근접해 있어 형광발생이 억제된다. Probe는 annealing step에서 주형과 상보적인 영역에서 특이적으로 hybridize하고, 이 때 형광물질과 quencher 물질과의 거리가 멀어져 quencher 물질에 의한 억제가 해소되어 probe상의 형광색소가 형광을 나타낸다. 한편 hybridize하지 않은 Molecular Beacon probe는 헤어핀 구조를 유지하고 있어 형광을 나타내지 않는다.

관련검사
Cytokine genes : Interleukine 1, Interleukine 4, Interleukine 5, Interleukine 9, Interleukine 10, Interleukine 13, Interleukine 15, Interferon-Gamma